原代細胞分離培養有哪些注意事項？

　　1、組織塊培養法

　?。?）接種后的前3天，觀察和移動時注意不要引起液體振蕩。避免頻繁的翻倒和振動，否則組織塊不易附著在瓶壁上或附著后脫落飄浮。

　　（2）加入的培養基不宜過多，以免浸泡的組織因輕微波動而脫落。

　?。?）細胞向外遷移時，注意記錄并清除漂浮的組織塊和殘留細胞。它們產生的有毒物質會影響原代細胞的生長。

　?。?）為促進組織塊盡快貼在培養瓶上，可在種植前在培養瓶底壁涂上一層薄薄的膠原蛋白。

 

　　2、貼壁原代細胞

　?。?）原代細胞分離培養的分離細胞一次接觸體外環境時，會相互影響。這些細胞之間可以產生一些促生長活性物質，促進細胞的存活和生長。如果接種細胞的密度過低，細胞間的促生長作用就很小，細胞分散后很難適應從體內組織環境到獨立生存環境的變化過程。如果接種的細胞密度過高，會導致營養供給不足，代謝廢物迅速堆積，需要頻繁換液和通過。

　?。?）適當提高原代培養接種的細胞密度，為培養細胞提供更多與體內相似的細胞間相互作用，將大大提高原代培養細胞在體外的存活率。當細胞適應體外環境后進行傳代培養時，以較低的密度進行接種和培養。

　?。?）接種后的細胞盡快貼壁是培養成功的關鍵。接種后可將培養瓶放入培養箱中培養3h～5h。待細胞貼壁后，可補充培養基繼續培養。

　　3、懸浮型原代細胞

　?。?）原代細胞分離培養細胞必須保持懸浮狀態。可以通過增加培養基的粘度來懸浮細胞，例如在培養基中加入低濃度的透明質酸復合物。將培養基加入帶攪拌裝置的培養容器中，最少5ml，否則攪拌時會產生氣泡，對細胞造成損傷。這種方式要注意攪拌速度不要太快，否則培養基會溢出，容易造成污染。如果培養基的量小于5ml，可以使用旋轉瓶進行培養。更換懸浮培養細胞溶液時，注意不要吸出細胞。

　?。?）可懸浮培養的細胞一般活力強，體外分裂增殖快，營養物質消耗大，換液時間間隔短。